cicCartuja Centro de Investigaciones Científicas de la cartuja
J. Am. Chem. Soc. 2023, Vol. 145, 16391-16397
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Las investigaciones sobre la naturaleza física y química de los procesos de reconocimiento molecular entre biomoléculas nos permiten comprender cómo dichas interacciones específicas regulan procesos que son esenciales de la vida. Esto resulta de vital importancia tanto para el avance en investigaciones biológicas fundamentales como para el diseño de nuevos fármacos. La espectroscopía de resonancia magnética nuclear, RMN, es una de las técnicas más potentes y fiables para llevar a cabo este tipo de investigación, y, en particular, la técnica de RMN por diferencia de transferencia de saturación (STD NMR, por sus siglas en inglés), destaca entre otras técnicas de RMN basadas en ligandos por ser una metodología fácil de aplicar y fiable. La técnica se basa en la observación de las señales espectroscópicas de los ligandos (molécula que interacciona específicamente con un receptor biológico, por ejemplo, una proteína, típicamente) en presencia de aquellas proteínas para las cuales se pretende encontrar o diseñar moléculas que interaccionen e interfieran de forma positiva en el proceso patológico en el que esté implicada dicha proteína terapéutica. La espectroscopía STD NMR proporciona información muy valiosa tanto sobre el modo de unión del ligando a la proteína (mapeo de epítopos de unión) como acerca de la fortaleza de la interacción (afinidad, medida como constante de disociación, KD).
Sin embargo, uno de los principales inconvenientes y limitación de la aplicación de la espectroscopía STD NMR al estudio de la especificidad y la afinidad de interacciones ligando-proteína es la necesidad de preparar un conjunto de muestras con distintas concentraciones de ligando, en un proceso denominado titulación del ligando. Cada muestra debe medirse independientemente, lo que supone un elevado tiempo de procesamiento experimental, aparte de la introducción de errores debidos a los procesos de mezclado a lo largo de las titulaciones, al ir añadiendo cantidades crecientes de ligando. Esto ha hecho que la aplicación de esta técnica tan potente no se haya visto apropiadamente expandida a lo largo de la comunidad de la industria farmacéutica, donde los tiempos de mediciones se pueden convertir en factores limitantes muy relevantes.
En este trabajo, proponemos una solución sencilla y potente a dichos problemas: en un trabajo colaborativo entre nuestro grupo y la School of Pharmacy de la University of East Anglia (Reino Unido), hemos desarrollado una nueva aplicación espectroscópica basada en la combinación de la espectroscopía STD NMR con la técnica RMN de imagen de desplazamiento químico (CSI) mediante el uso de gradientes, para desarrollar la técnica de STD NMR de imagen (imaging-STD NMR). Estos experimentos CSI utilizan codificación de fase con gradientes de campo para adquirir espectros de 1D 1H STD NMR a distintas profundidades, o cortes, de la muestra consistente en una disolución homogénea de proteína en presencia de un gradiente de concentración de ligando en un único experimento. Así, en este experimento, cada corte representa una relación [ligando]:[proteína] en una sola muestra, en lugar de una titulación tradicional en la que se añaden manualmente pequeñas adiciones de ligando al tubo para aumentar gradualmente la relación [ligando]: [proteína].
La aplicación de la RMN de imagen STD que proponemos aquí nos permite determinar las constantes de disociación (KD) y evaluar la especificidad de la unión en un solo tubo de muestra. Según las primeras estimaciones la espectroscopía STD NMR de imagen requiere tan sólo el 20% del tiempo experimental necesario para los experimentos STD NMR convencionales. Este ahorro de tiempo puede tener un impacto enorme en la industria farmaceútica, abriendo la puerta al estudio de un mayor número de fragmentos moleculares potencialmente activos que pudieran llegar a convertirse en nuevos fármacos.
Jesús Angulo en el Laboratorio de Interacciones Biomoleculares y Glicobiología Estructural, del Instituto de Investigaciones Químicas
Artículo original: Serena Monaco*,Jesús Angulo y Matthew Wallace*: Imaging Saturation Transfer Difference (STD) NMR: Affinity and Specificity of Protein–Ligand Interactions from a Single NMR Sample. J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 30, 16391–16397: https://doi.org/10.1021/jacs.3c02218
